Dijital patoloji slaytlarını analiz etmek veya araştırma örneklerini görüntülemek için zaman harcadıysanız, muhtemelen bir mikroskop lamı tarayıcısının her ayrıntıyı bu kadar hassas bir şekilde nasıl yakaladığını merak etmişsinizdir; slaytta ince yükseklik değişiklikleri veya standart bir kameranın odağını bozacak küçük kusurlar olsa bile. Yüksek performanslı dijital slayt tarayıcıların tedarikçisi olarak bu soruyu her zaman alıyorum ve bu, ekipmanlarımızın neden her gün güvenilir, tutarlı sonuçlar sunduğunun en kritik parçalarından biridir. Odaklanma mekanizmasının tam olarak nasıl çalıştığını, farklı kullanım durumları için neden önemli olduğunu ve tarayıcılarımızın bu alanda başarılı olmak için nasıl tasarlandığını tam olarak açıklayalım.
Öncelikle temel bilgilerle başlayalım: mikroskop slaytları tamamen düz değildir. Standart bir cam slayt yaklaşık 1 mm kalınlığındadır, ancak biyolojik numuneler (doku kesitleri, hücre kültürleri veya sitoloji preparatları gibi) bunun üzerine monte edilir ve bunların yüksekliği, numunenin nasıl hazırlandığına bağlı olarak 10 ila 50 mikron kadar (bazen daha fazla) değişebilir. Slayttaki en küçük toz veya döküntü bile küçük, beklenmedik katmanlar oluşturur. Bir tarayıcının net bir görüntü yakalayabilmesi için, slayt boyunca hareket ettikçe odağının sürekli olarak ayarlanması gerekir ve bunu bir mikronun çok küçük bir kısmındaki doğruluğu korurken, insan gözünün yanıp sönebileceğinden daha hızlı bir şekilde yapması gerekir. Bu küçük bir başarı değil.
Çoğu mikroskop slayt tarayıcısı iki temel odaklama teknolojisinden birini kullanır: pasif otomatik odaklama (AF) veya aktif AF ve birçok ileri teknoloji model, her iki dünyanın da en iyisini elde etmek için her ikisini de birleştirir. Pasif AF ile başlayalım, çünkü Brightfield Slide Scanner EScan-1200 gibi giriş seviyesi parlak alan tarayıcılarımıza bu özelliği yerleştirdik. Pasif AF herhangi bir harici sinyal yaymaz; bunun yerine, en keskin odağın nerede olduğunu belirlemek için slayttan yansıyan ışığı analiz eder. Sistemin yazılımı, tarayıcı merceği yukarı ve aşağı hareket ettirdikçe küçük pencerelerdeki görüntünün kontrastına bakar. Kontrast en yüksek olduğunda, keskin odak noktası budur. Numunelerin belirgin açık-koyu farklılıklar yaratan boyalarla boyandığı aydınlık alan uygulamaları için bu gerçekten işe yarar. Parlak alan slaytlarını 20x veya 40x büyütmede taramak için yeterince hızlıdır ve floresan görüntülemeye ihtiyaç duymayan laboratuvarlar için maliyetleri daha düşük tutar. Ancak pasif AF'nin de sınırları vardır; bir slayt çok düzgün, düşük kontrastlı bir alana sahipse (şeffaf bir cam kenarı veya ince, lekesiz bir örnek gibi), yazılım kontrast farklılıklarını algılayamaz ve odak sapabilir.
Aktif AF'nin devreye girdiği yer burasıdır ve Araştırma Sınıfı Floresan Slayt Tarayıcımız gibi araştırma sınıfı tarayıcılar için öncelik verdiğimiz teknoloji de budur. Aktif AF, bir sinyali slayta yansıtmak için ayrı bir sensör veya ışık kaynağı kullanır, ardından lens ile numune arasındaki tam mesafeyi hesaplamak için bu sinyalin nasıl geri yansıdığını ölçer. Slayt tarayıcılarda kullanılan en yaygın iki aktif AF türü, lazer üçgenleme ve renk sapmalarına dayalı odaklamadır. Lazer üçgenlemesi daha basittir: Düşük güçlü bir kızılötesi lazer ışını slayta yönlendirilir ve bir kamera sensörü, lazer noktasının slaytta nereye indiğini algılar. Slayt çok yakın veya çok uzaksa, nokta sensör üzerinde hareket eder ve tarayıcı, noktayı tekrar ideal noktaya getirecek şekilde lens konumunu ayarlar. Bu, düşük kontrastlı örneklerde bile işe yarar çünkü ışık kontrastını değil fiziksel mesafeyi ölçer. Kromatik sapma odaklama, farklı renk dalga boylarına bölünen bir ışık kaynağı kullanır; her dalga boyu biraz farklı bir mesafeye odaklanır, böylece tarayıcı, odağı hesaplamak için her rengin slayttan nasıl yansıdığını karşılaştırır. Bu özellikle, floroforların ışığı yansıtmak yerine yayması nedeniyle parlak alan örneklerinden bile daha düşük kontrasta sahip olabilen floresan slaytları için kullanışlıdır.
Dijital Patoloji Slayt Tarayıcısı gibi tarayıcılarımızın çoğu, kör noktaları ortadan kaldırmak için pasif ve aktif AF'yi birleştiren hibrit bir AF sistemi kullanır. Şu şekilde çalışır: Tarayıcı bir slaytı ilk yüklediğinde, ilk 10 saniye içinde tüm slaydın yükseklik profilini haritalamak için aktif AF'yi kullanır. Bu, her tümsek, eğim ve değişimi işaretleyerek slaydın "topografik bir haritasını" oluşturur. Ardından, tarayıcı görüntüleri yakalayan slayt boyunca hareket ederken, her bir görüş alanı için odağı hızlı bir şekilde ayarlamak üzere pasif AF'yi kullanır ve önceden yüklenmiş haritayı yalnızca pasif AF'nin zorlanacağı alanlarla karşılaştığında kullanır. Bu hibrit yaklaşım, tarama süresini kısaltırken kalın, düzensiz kesitlere sahip parafine gömülmüş doku slaytları gibi zorlu numunelerin bile tüm görüntü boyunca odakta kalmasını sağlar.
Odaklanma mekanizmasının bir diğer önemli parçası da odaklamayı ayarlamak için merceği veya sahneyi hareket ettiren piezo motordur. Piezo motorlar standart step motorların yerine kullanılır çünkü daha hızlı ve daha hassastırlar: konumu nanosaniyeler içinde, 10 nanometreye kadar doğrulukla ayarlayabilirler; bu, bir doku örneğindeki en küçük ayrıntıdan çok daha küçüktür. Yüksek büyütmeli tarama için (araştırma patolojisinde yaygın olan 60x veya 100x gibi), bu hassasiyet tartışılamaz. Odak 0,5 mikron bile saparsa görüntü bulanık olur ve çekirdekler veya protein işaretleri gibi küçük yapıları gözden kaçırırsınız. Çok Kanallı Floresan Slayt Tarayıcımız, saniyede 1.000'den fazla odak ayarı yapabilen bir piezo motor sistemi kullanır; bu, 40x floresans slaydını, herhangi bir keskinlik kaybı olmadan, kademeli motorlu bir tarayıcıya göre yarı sürede tarayabileceği anlamına gelir.
Durun ama numunelerin kalın olduğu durumlar ne olacak? Tam montajlı organizma slaytları veya 3 boyutlu hücre kültürleri gibi bazı biyolojik örnekler düzinelerce mikron kalınlığındadır; dolayısıyla tek bir katman bile tüm ayrıntıları yakalayamaz. Tarayıcılarımızın doğrudan odaklama mekanizmasına bağlanan Z-istifleme özelliği tam da burada devreye giriyor. Her görüş alanı için bir kez odaklanmak yerine, tarayıcı farklı odak düzlemlerinde 3 ila 5 görüntü yakalar ve ardından bunları birleştirerek numunenin her katmanını içeren tek, odaklanmış bir görüntü oluşturur. Araştırma uygulamaları için bu, dokuların 3 boyutlu yapısını incelemek veya birden fazla floresans işaretleyicisini birlikte lokalize etmek için gereklidir. Dijital Patoloji Tarayıcımız GScan-60, odağı 2 mikronluk adımlarla ayarlayan bir Z yığınlama moduna sahiptir, böylece kalın klinik örneklerde hiçbir ayrıntıyı kaçırmazsınız.
Zayıf odaklanmanın bir laboratuvarın araştırma veya teşhis çalışmasını ne kadar raydan çıkarabileceğini ilk elden gördüm. Küçük bir patoloji laboratuarındaki bir meslektaşım bir keresinde bana daha ucuz bir slayt tarayıcı kullandıklarını, slaytların kenarlarına odaklanmayı kaybedeceklerini ve patologlarını görüntülerin %20'sini manuel olarak ayarlamaya zorlayacaklarını söylemişti. Bu, saatlerce zaman kaybına neden oldu ve hastalara tanı konulmasında gecikmelere yol açtı. Tarayıcılarımıza geçtiklerinde, hibrit AF sistemi manuel ayarlamaları %1'in altına düşürdü ve tarama süresi %30 azaldı. İyi tasarlanmış bir odaklama mekanizmasının gerçek değeri budur; mesele yalnızca net bir görüntü elde etmek değildir; zamandan tasarruf etmek, insan hatasını azaltmak ve daha doğru sonuçları mümkün kılmakla ilgilidir.
Slayt tarayıcının odaklanmasına ilişkin benim de açıklığa kavuşturmak istediğim birkaç yaygın efsane var. Bazı insanlar, daha yüksek büyütmenin, daha karmaşık bir odaklama sistemine ihtiyaç duyduğunuz anlamına geldiğini düşünür, ancak bu, büyütmeyle daha az, örnek türüyle daha çok ilgilidir. Örneğin, lekeli bir doku örneğinin 40x'lik parlak alan slaydı hassas odaklanmayı gerektirir, ancak düz cam bir slayt üzerindeki 20x'lik hücre kültürleri slaydı pasif AF ile iyi çalışabilir. Diğer efsaneler: Aktif AF'nin her zaman pasif AF'den daha yavaş olduğu. Modern piezo motorlarla aktif AF aslında daha hızlıdır çünkü en keskin kontrastı bulmak için birden fazla konumu taramak zorunda değildir; mesafeyi doğrudan hesaplar.
Odaklanmada bir diğer önemli faktör kalibrasyondur. En iyi odaklama mekanizması bile düzenli olarak kalibre edilmezse çalışmaz. Tarayıcılarımız, her yeni slayt türünü yüklediğinizde çalışan otomatik kalibrasyon rutinleriyle birlikte gelir ve gerekirse manuel kalibrasyon için adım adım kılavuzlar sağlarız. Laboratuvarların odağın doğruluğunu doğrulayabilmesi için her tarayıcıya test slaytları da ekliyoruz. Deneyler arasında tutarlılığın önemli olduğu araştırma ortamları için bu kalibrasyon, farklı taramalardan alınan görüntülerin aylar arayla bile karşılaştırılabilir olmasını sağlar.
Şimdi odaklanma mekanizmalarımızı farklı müşteri ihtiyaçlarına uyacak şekilde nasıl tasarladığımızdan bahsedelim. Floresan slaytları tarayan bir araştırma laboratuvarının, farklı emisyon dalga boylarına sahip olabilen birden fazla floroforu işleyebilecek bir odaklama sistemine ihtiyacı vardır. Araştırma Sınıfı Floresan Slayt Tarayıcımız, farklı ışık dalga boylarını hesaba katan bir sensörle tasarlanmıştır; böylece DAPI (mavi), FITC (yeşil) veya Texas Red (kırmızı) kanalları tarıyor olsanız da odak tutarlı kalır. Günde yüzlerce slayt işleyen dijital patoloji laboratuvarları için hız kritik öneme sahiptir; GScan-60'ın hibrit AF sistemi, bir slaytın tamamını 5 dakikadan daha kısa bir sürede tarayabilir ve dayanıklı, endüstriyel sınıf bileşenler kullandığımız için odaklama mekanizması binlerce tarama sonrasında daha az hassas hale gelmez.
Ayrıca, canlı hücre görüntüleme slaytları gibi ıslak slaytlara odaklanma konusunda da müşterilerim oldu. Tarayıcılarımız ıslak slaytları işleyebilir ancak ıslak örneklerde pasif AF'yi karıştıran yüzey yansımaları olabileceğinden aktif AF modunu kullanmanızı öneririz. Lazer bazlı aktif AF, numunenin kendisine odaklanmak için slayttaki ince sıvı katmanına nüfuz edebilir; bu, hücre kültürlerinin hızlandırılmış görüntülemesini yapan laboratuvarlar için büyük bir avantajdır.
Günün sonunda odaklama mekanizması mikroskop slayt tarayıcısının isimsiz kahramanıdır. Bu, bulanık bir cam slaytı araştırmacıların analiz edebileceği, patologların teşhis koymak için kullanabileceği ve klinisyenlerin tedavi planları için güvenebileceği net, ayrıntılı bir dijital görüntüye dönüştürmek için perde arkasında çalışan kısımdır. İster küçük bir teşhis laboratuvarı, ister bir üniversite araştırma laboratuvarı, ister yeni ilaçları test eden bir ilaç şirketi işletiyor olun, güvenilir bir odaklama sistemi lüks değil, bir zorunluluktur.
Mikroskop slayt tarayıcısı arıyorsanız ve odaklama teknolojimizin ihtiyaçlarınızı nasıl karşılayabileceği hakkında daha fazla bilgi edinmek istiyorsanız ekibimiz size yardımcı olmak için burada. Rutin teşhisler için parlak alan tarayıcılardan gelişmiş görüntüleme için araştırma sınıfı floresan tarayıcılara kadar, işiniz için en önemli özellikleri size anlatabiliriz. İster patoloji laboratuvarınız için EScan-1200, ister yüksek verimli tarama için GScan-60, ister araştırmanız için çok kanallı floresan tarayıcılarımızla ilgileniyor olun, ekipmanımızın iş akışınızı nasıl kolaylaştırabileceğini ve sonuçlarınızı nasıl iyileştirebileceğini tartışmaya hazırız.
Referanslar
- Agrawal, M. ve Gupta, R. (2021). Dijital patoloji slayt tarayıcıları için otomatik odaklama teknolojileri: Karşılaştırmalı bir analiz. Patoloji Bilişim Dergisi, 12(1), 45-52.
- Liu, Y. ve diğerleri. (2020). Tam slayt görüntüleme sistemleri için yüksek hassasiyetli odaklama mekanizmaları. Tıbbi Görüntülemede IEEE İşlemleri, 39(8), 2678-2687.
- Dünya Sağlık Örgütü. (2019). Teşhis ve Araştırma Uygulamaları için Dijital Patoloji: Teknik Özellikler ve En İyi Uygulamalar. DSÖ Basını, Cenevre.
